利用綜合可視化模型協(xié)助研究
對(duì)所有生物樣本進(jìn)行三維成像，從細(xì)胞器到細(xì)菌、多層體細(xì)胞、組織切片及小的模式生物體。熒光顯微鏡技術(shù)擁有卓越性能，可以用于處理經(jīng)特殊標(biāo)記的蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)及細(xì)胞器。然而，當(dāng)您在樣品內(nèi)對(duì)這些目標(biāo)進(jìn)行成像時(shí)，焦平面的上下兩個(gè)方向會(huì)發(fā)射出熒光，之后會(huì)被物鏡捕獲。這種效應(yīng)會(huì)使獲得的圖像模糊，降低分辨率。諸如光學(xué)切片等最新的三維成像方法能幫助您從熒光樣品中獲取 出色 的三維圖像。一般而言，三維成像技術(shù)依賴(lài)于數(shù)學(xué)算法、光學(xué)硬件或兩者結(jié)合來(lái)消除或最大限度地減少非焦平面外的熒光。
在光學(xué)顯微鏡下使用光學(xué)切片的三維成像技術(shù)
去卷積是一種基于數(shù)學(xué)模型的三維成像方法。通過(guò)去卷積計(jì)算方法將雜散光重新投射回其原點(diǎn)來(lái)恢復(fù)模糊圖像。使用焦平面和非焦平面外發(fā)射的所有熒光信號(hào)，因此這項(xiàng)光學(xué)切片法非常靈敏且特別適用于微弱熒光樣品和活體細(xì)胞成像。借助 ZEN軟件中 去卷積（Deconvolution）模塊，您可以輕松實(shí)現(xiàn)寬場(chǎng)熒光圖像的光學(xué)切片。
ApoTome.2 結(jié)構(gòu)照明技術(shù)是基于將柵格結(jié)構(gòu)投影在焦平面同時(shí)在一定范圍內(nèi)精確移動(dòng)。專(zhuān)利算法則是利用至少三張具有不同柵格位置的單幅圖像計(jì)算出高解析度的光學(xué)切片圖像。采集組織切片和整個(gè)生物的多通道三維圖像，僅需將 ApoTome.2 插入蔡司顯微鏡的視場(chǎng)光闌位置即可獲得令人驚嘆的三維成像效果。
孔徑相關(guān)（Aperture correlation）綜合了結(jié)構(gòu)照明的光效率和 VivaTome 轉(zhuǎn)盤(pán)的高速度。激發(fā)光與發(fā)射光通過(guò)帶有柵格的旋轉(zhuǎn)圓盤(pán)達(dá)到共軛平面。由于轉(zhuǎn)盤(pán)優(yōu)化了激發(fā)光透射，因此借助普通白光光源便能實(shí)現(xiàn)高光效率。來(lái)自焦平面的發(fā)射光與 50% 非焦平面的發(fā)射光一起通過(guò)轉(zhuǎn)盤(pán)并被檢測(cè)到。另外 50% 的非焦平面的發(fā)射光則被轉(zhuǎn)盤(pán)反射，在捕獲后用于創(chuàng)建第二幅圖像。兩幅圖像相減即可得到光學(xué)切片圖像。因此，您可以使用 VivaTome 的孔徑相關(guān)原理對(duì)動(dòng)態(tài)過(guò)程進(jìn)行高幀率和高對(duì)比度成像。
共聚焦顯微鏡技術(shù) 則使用發(fā)射光光程共軛平面內(nèi)的點(diǎn)光源和針孔來(lái)抑制非焦平面的雜散光。這項(xiàng)技術(shù)是一款用于較厚樣品成像的強(qiáng)大工具，并能在 z 軸方向上獲得高分辨率。然而，其對(duì)于無(wú)法發(fā)出足夠亮熒光信號(hào)的樣品是個(gè)挑戰(zhàn)。蔡司激光掃描顯微鏡 LSM 710 和 LSM 780 配備具有 45% 量子效率的高靈敏探測(cè)器。借助出色的信噪比和較短的曝光時(shí)間，甚至可實(shí)現(xiàn)高難度樣本成像。選用 Cell Observer SD 可以快速、柔和地監(jiān)測(cè)活體樣本。此三維成像解決方案采用了轉(zhuǎn)盤(pán)技術(shù)，利用轉(zhuǎn)盤(pán)上的多個(gè)針孔以超高采集速度獲取三維共聚焦圖像。
選擇性激發(fā)是指僅激發(fā)所需焦平面內(nèi)的熒光基團(tuán)來(lái)創(chuàng)建光學(xué)切片。 這可使用 LSM 7 MP 多光子顯微技術(shù)或 LSM 710NOL 和 780NLO 非線(xiàn)性附件來(lái)實(shí)現(xiàn)。若使用紅外范圍內(nèi)的低能量波長(zhǎng)，則需兩個(gè)光子激發(fā)熒光基團(tuán)。因此，主要在激光束密集聚焦的焦平面內(nèi)產(chǎn)成熒光。另外，由于使用了較長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)，所以降低了散射和光損傷。在無(wú)光漂白和無(wú)光毒效應(yīng)時(shí)，甚至可以獲得 1 毫米深度的圖像。激光層照熒光顯微技術(shù)（LSFM）是另一種使用選擇性激發(fā)的技術(shù)。? 激發(fā)光光路與發(fā)射光光路分離，且僅照射樣本的焦平面。利用 MultiView 成像和培養(yǎng)裝置，Lightsheet Z.1 能夠輕松在長(zhǎng)達(dá)幾小時(shí)甚至數(shù)天內(nèi)監(jiān)測(cè)胚胎和器官組織發(fā)育。
三維超高分辨率顯微技術(shù)
超高分辨率結(jié)構(gòu)照明顯微技術(shù)（SR-SIM）是一種用于實(shí)現(xiàn)三維采集的通用、靈活熒光技術(shù)。相干激光的一個(gè)非常精細(xì)的相位柵格在樣品上旋轉(zhuǎn)和移動(dòng)，用以激發(fā)熒光基團(tuán)。通過(guò)樣品結(jié)構(gòu)柵格的干涉條紋，在疊加照明柵格后生成第三種圖案。它會(huì)比樣品小結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的精細(xì)圖案要寬，因此可由透鏡發(fā)射。然后從這些信息中計(jì)算出超高分辨率圖像。通過(guò)這種方法可以提高橫向，尤其是軸向的分辨率。ELYRA S.1 和 ELYRA PS.1 能夠?qū)崿F(xiàn)任一傳統(tǒng)熒光基團(tuán)的三維成像。分辨率是傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的兩倍，并通過(guò) z 軸切片實(shí)現(xiàn)三維圖像采集。
電子顯微鏡三維成像
掃描電子顯微鏡能以驚人的分辨率對(duì)生物微觀結(jié)構(gòu)成像，并與三維成像組合使用。? 使用樹(shù)脂包埋樣品，然后在樣品室內(nèi)使用超薄切片機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行切片。在每次切片后對(duì)樣品塊成像，并生成一系列電子顯微鏡圖像，然后組合成最終的三維數(shù)據(jù)集。這一技術(shù)也被稱(chēng)為系列連續(xù)切片成像技術(shù)（SBF-SEM），蔡司掃描電子顯微鏡可以提供。 MERLIN 3View 和 SIGMA 3View 中充分利用了 Gatan 公司研制的簡(jiǎn)便、快捷的 SBF-SEM 技術(shù)。另一種實(shí)現(xiàn)方法則是使用聚焦離子束，運(yùn)用在蔡司 FIB-SEM 系統(tǒng)，用以磨蝕樣本表面并借助 ATLAS 3D 軟件進(jìn)行重構(gòu)。超薄切片機(jī)是一種更快速的方法，而聚焦離子束則能實(shí)現(xiàn)更精細(xì)的樣品切割。